听说你们今年在玩小游戏做实验？挺好，我们去年刷试管，一刷刷一盆！
小虫实验目的
1.通过制备营养琼脂，营养肉汤，半固体琼脂培养基，掌握培养基制备的原则和方法。
2.医院空气的有菌环境，加强消*灭菌的观念；医院病房空气的细菌检测方法；掌握空气的卫生细菌学监测指标及意义；了解人体体表的有菌环境，加强消*灭菌的观念；
3.通过平板分区划线法掌握细菌的分离、纯化与培养方法。通过斜面培养基接种法掌握细菌的纯培养方法。通过肉汤培养纯菌种。
4.掌握油镜的使用方法，细菌涂片标本的制备方法和革兰氏染色法，通过油镜观察革兰氏染色后的脓汁和粪便标本涂片中病原菌个体形态特征。
5.通过糖发酵试验鉴定大肠埃希菌和肠道致病菌。通过血浆凝固酶鉴定金*色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通过药物敏感试验，了解脓汁和粪便标本中病原菌对于青霉素，庆大霉素和链霉素的敏感性。通过半固体穿刺接种法，鉴定大肠埃希菌和肠道致病菌。
实验器材1.培养基的制备：干粉培养基、蒸馏水、天平、称量皿、药勺、锥形瓶、量筒、电炉、洗耳球、试管框、移液管、棉塞、牛皮纸、纸绳、手套、石棉网、橡皮筋
2.细菌的分离培养：脓汁标本，粪便标本、普通培养琼脂平板，伊红美蓝琼脂平板，接种环，酒精灯，打火机，接种针，油性笔
3.细菌的纯培养：接种环、酒精灯、打火机、中性笔、斜面培养基
4.细菌的形态学检查：斜面培养物、营养肉汤、生理盐水、镜油瓶、拭镜纸、吸水纸、载玻片、显微镜、打火机、中性笔、革兰染色机（结晶紫试剂、卢戈碘液、0.95乙醇、稀释稀释复红染液）、液体培养基
5.细菌的生化试验：葡萄糖发酵管、乳糖发酵微量管、接种针、酒精灯、打火机、中性笔、菌液、营养琼脂平板、接种环、药物纸片（青霉素、庆霉素、头孢曲松）、玻片、兔血将、生理盐水
6.细菌的血清学试验:玻片、福式志贺菌诊断血清、生理盐水、接种环、酒精灯
方法与步骤
1.培养基的制备：称取一定量的营养琼脂，制备肉汤培养基、营养琼脂、半固体琼脂培养基，置于锥形瓶中，加入适量的蒸馏水。培养基隔石棉网煮沸，使完全溶解。营养肉汤煮沸一次，含琼脂的培养基煮沸三次，趁热分装。高压蒸汽灭菌为培养细菌备用。
组号
培养基
称量
水量
煮沸
分装
备注（50人份）
1
营养琼脂
11.4g
ml
-
-
5瓶，ml瓶，平板
2～4
营养琼脂
3.7g
95ml
3次
5ml
19支×3，中试管，斜面
5～7
营养肉汤
1.3g
60ml
1次
3ml
19支×3，小试管，肉汤
8～10
半固体琼脂
2.3g
80ml
3次
4ml
19支×3，小试管，高层
2.空气沉降细菌学检查：根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位（colonyformingunit，CFU），可了解空气的污染情况。每组1个琼脂平板，做标记。选择采样地点：实验室、卫生间或任选地点。严格无菌操作，将平板盖打开，移动放置在平皿边缘；平板暴露于空气中15分钟，反向盖上。37℃温箱培养24小时，观察结果。
3.手指皮肤的细菌学检查：
4.细菌的分离培养：平板分区划线分离脓汁和粪便标本，小组内分工，甲和乙取脓汁标本在营养琼脂平板上划线，丙和丁取粪便标本在伊红美蓝平板上划线。接种环烧灼灭菌，取标本在平板表面上方密集涂布5—10mm2，烧掉接种环上多余的标本。晃动平板，接种环与平板呈30到40度角，通过密集涂布部分3次，使接种环重新沾上少量标本，然后在平板表面以曲线形式来回连续划线，每区划线不少于30条。依次完成2到5区的划线。接种环烧灼灭菌。将平板倒置，37℃培养18—24h，观察结果并记录。
5.细菌的纯培养：斜面接种，小组内分工，甲和乙分别挑取普通琼脂平板上培养出的*色和白色单菌落，丙和丁分别挑取伊红美蓝平板上的紫黑和粉红菌落接种到斜面培养基上。斜面培养基置于37℃培养过夜。
6.细菌的形态学检查：涂片制备，小组内分工，甲和丙制备*色和紫黑涂片，乙和丁制备白色和粉红涂片。革兰氏染色用接种环取生理盐水2滴到玻片上，再从斜面培养基中取少许菌落与盐水混匀，涂成大于1cm2，接种环灭菌。涂片干燥并经酒精灯火焰固定。在细菌涂片上滴加结晶紫染液1—2滴初染，一分钟后流水冲洗。加碘液1—2滴媒染，一分钟后流水冲洗。滴加95%酒精数滴，轻轻摇动涂片，均匀脱色，继续滴加酒精，直到流下的酒精无色或者淡紫色为止（约30s），用流水冲洗。加稀释复红染液1—2滴，经一分钟复染，用流水冲洗，倾去余水，用吸水纸擦干，观察染色后涂片的颜色。油镜镜检，在10倍物镜下观察制备好的涂片标本，调整好标本的位置，滴加香柏油，换倍镜浸泡油中，几乎与标本接触，观察镜下标本中细菌个体形态特征，记录，擦镜纸擦去香柏油，将显微镜放回原处。
7.接种环肉汤接种增菌：通过无菌操作挑取菌苔少许，立即移入肉汤培养基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，并沾取少量肉汤调和，使菌液混合于培养基中，混匀。接种完毕后，试管口和接种环烧灼灭菌。
8.细菌的生化检验：
①糖发酵试验：通过无菌操作，用灭菌接种针刮取细菌培养物少许，分别接种在葡萄糖发酵微量管里和乳糖发酵微量管里。将微量管平放在平皿盖里，37°培养过夜后观察结果。小组分工，甲和乙挑取紫黑菌苔，丙和丁挑取粉红菌苔。
②滤纸片扩散法药物敏感试验：接种环2次取菌液3—5ul，在平板培养基表面，密集划线接种细菌。甲接种*色菌液，乙接种白色菌液，丙接种紫黑菌液，丁接种粉红菌液。在平板培养基上设计三点，呈等边三角形，点距离平皿边缘约15mm，分别做青霉素，链霉素和庆大霉素的标记。用消*的镊子夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，37℃培养18到24小时，观察结果。
③凝固酶试验：取两滴兔血浆置于洁净的玻片上。分别用接种环取白色和*色菌苔与血浆研磨混合，立即观察结果。
④半固体穿刺法实验：用接种针斜面取菌，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。小组分工，甲和乙接种紫黑菌落，丙和丁接种粉红菌落。37℃培养18—24h，观察结果。
9.细菌的血清学实验：取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为实验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul，用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。再观察结果。
四．结果与讨论
（一）实验结果：
1
2.细菌的分离培养结果：
(1)从脓汁标本中分离出*色和白色两种菌落，菌落直径2mm左右，圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明（图1）。
图1脓汁标本营养琼脂平板划线分离结果（可观察到*色和白色单菌落）
(2)用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落（图2）。
图2粪便标本伊红美兰平板划线分离（看观察到紫黑色，粉红色单菌落）
2.细菌的纯培养结果:
(1)对分离出的白色菌和金*色菌分别进行斜面纯培养（图3）,从普通平板上挑取的*色或白色的菌落接种的斜面,菌苔的颜色,还是原来的菌落的颜色,*色或白色.
图3斜面培养（左为金*色细菌，右为白色细菌）
(2)对分离出的紫黑菌和粉红菌分别进行斜面纯培养（图4）,从伊红美蓝挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面,已经没有原来的颜色.菌苔灰白色,表面湿润,光滑,前者不透明.后者透明.
图4斜面培养（左为紫黑色细菌，右为粉红色细菌）
3.细菌的形态学检测结果:
(1)金*色菌和白色菌经革兰氏染色，油镜下观察，这两种细菌均为革兰氏阳性菌，排列不规则，呈葡萄串状，是葡萄球菌（图5）。
图5脓汁标本革兰染色（左为金*色葡萄球菌，右为白色葡萄球菌）
(2)紫黑色或粉红色菌经革兰染色均为革兰氏阴性菌（图6）
图6粪便标本革兰染色染色（左为大肠埃希菌，右为福氏志贺菌）
5.细菌的生化试验:
(1)糖发酵试验结果:经糖发酵试验，接种了紫黑色菌的葡萄糖管和乳糖管都变为*色且产气，接种了粉红色菌的葡萄糖管变为*色，不产气，乳糖管不变色，不产气（图7）。
图7粪便标本两种细菌乳糖、葡萄糖发酵实验（从下至上分别为葡萄糖产酸产气（大肠埃希菌）乳糖产酸产气（大肠埃希菌）葡萄糖产酸不产气（福氏志贺菌）乳糖不产酸不产气（福氏志贺菌））
（2）抗菌素敏感试验结果：做滤纸片药物敏感试验的结果是，青霉素、头孢曲松和庆大霉素纸片在脓汁标本金*色菌培养皿上扩散的抑菌圈直径分别是46mm、29mm、32m,对青霉素、头孢曲松和庆大霉素敏感.。青霉素、头孢曲松和庆大霉素纸片在脓汁白色色菌落上扩散的抑菌圈直径分别是33mm、23mm、37mm，对青霉素、头孢曲松和庆大霉素敏感。进一步验证了*色菌苔和白色菌苔为革兰氏阳性菌的结论。青霉素、头孢曲松和庆大霉素纸片在粪便标本紫黑色菌落中扩散的抑菌圈直径分别是0mm，35mm，30mm，对青霉素不敏感，对头孢曲松、庆大霉素敏感。青霉素、头孢曲松和庆大霉素纸片在粪便标本粉红色菌落中扩散的抑菌圈直径分别是0mm，35mm，24mm。对青霉素不敏感，对头孢曲松、庆大霉素敏感。说明二者对庆大霉素和头孢曲松敏感，对青霉素不敏感，均为革兰氏阴性菌。（图8）
图8药敏实验（从左到右，上面两个分别为金*和白色菌，下面两个为紫黑和粉红菌）
（3）血浆酶凝固酶试验结果：金*色菌出现明显凝块，白色菌没有出现凝块（图9）。结合菌落的颜色金*色和白色，推测这两种菌分别是金*色葡萄球菌和白色葡萄球菌。因为血浆凝固酶实验金*色葡萄球菌为阳性，金*色葡萄球菌为致病菌。
图9脓汁标本兔血浆凝固酶实验（右呈阳性，金*色葡萄球菌；左呈阴性，白色葡萄球菌）
（4）半固体穿刺法实验的结果：紫黑菌沿穿刺线生长，边缘清晰。粉红菌向穿刺线周围生长，使培养基扩散呈云雾状浑浊状态。因此，紫黑菌为有鞭毛的菌，粉红菌为无鞭毛的菌落（图10）。
图10粪便两种细菌动力试验（左边为阳性，右边为阴性。阳性为有鞭毛，为大肠埃希菌。阴性为无鞭毛为福氏志贺菌）
6.血清学凝集试验结果：紫黑菌为大肠埃希菌，粉红菌为肠道致病菌。用福氏志贺菌诊断学清，检测发生凝集（图11），则菌落为粉红色肠道致病菌为福氏志贺菌。
图11玻片凝集试验（左侧不发生凝集为大肠埃希菌，右侧凝集为福氏志贺菌）
（二）实验数据
表1药敏实验菌落抑菌圈直径(mm)
青霉素
头孢曲松
庆大霉素
金*色菌落
46
29
32
白色菌落
33
23
37
紫黑菌落
0
35
30
粉红菌落
0
35
24
表2所有实验项目实验结果
标本
菌落颜色
革兰氏染色
血浆凝固酶
葡萄糖
乳糖
半固体培养基
福氏志贺菌诊断血清
青霉素
头孢曲松
庆大霉素
结论
脓汁
*色
G+球菌
＋
+
+
+
金*色葡萄球菌
白色
G+球菌
－
+
+
+
白色葡萄球菌
粪便
紫黑
G-杆菌
⊕
⊕
＋
－
+
+
大肠埃希菌
粉红
G-杆菌
＋
－
－
＋
－
+
+
褔氏志贺菌
+产酸或阳性，⊕产酸产气，+阳性，-不产酸不产气或阴性
（三）实验结论：
采用平板划线分离法，从脓汁标本中分离出金*色和白色两种菌落。显微镜下，这两种细菌均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌；结合菌落或菌苔颜色，这两株葡萄球菌分别是金*色葡萄球菌和白色葡萄球菌。通过血浆凝固酶试验鉴别，金*色葡萄球菌是致病菌。用伊红美蓝平板，从粪便标本中分离出紫黑色具有金属光泽和粉红色半透明菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，它们都是G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。经糖发酵试验，半固体动力试验，血清学试验结果鉴定，它们分别是大肠埃希菌和福氏志贺菌
（四）结果讨论及注意事项：
1.各类细菌分离与培养方法的特点：
平板划线法：分离标本中的菌落，借助划线将混杂的细菌在琼脂平板上分离开来，在适宜温度下生长繁殖以后，形成肉眼可见的菌落。进而观察菌落形态特征。
斜面培养基接种法：用于细菌增殖和传代、保存。
液体培养基：用于测定细菌的生化特性。
半固体培养基穿刺接种法：用于观察细菌有无运动能力，进而判断有无鞭毛。
2.平板划线时，取菌液量要合适。本实验出现平板划线分离失败，三、四、五区无细菌。可能为从二区划线时没能沾到细菌。
3.粪便标本在伊红美蓝平板的显色：紫黑色和粉红色不是细菌本身的颜色，产生的原因是大肠埃希菌分解乳糖产酸，酸使伊红和美蓝结合，形成紫黑色具有金属光泽、大而隆起、不透明的菌落。福氏志贺菌是致病菌，不分解乳糖，菌落呈伊红的颜色，淡粉红色，半透明。
4.革兰氏染色时，涂片标本制备时，涂片不可过厚，否则在油镜下难以分清单个细菌的形态。固定时温度不可以过高，否则可能使细胞形态改变。用水流冲洗时水流不能过于大急，负责标本被冲走，在镜下找不到单个的细菌（本实验丁同学冲洗时水流太大，将标本冲走，导致镜下观察不到）。
5.糖发酵试验：不同细菌有不同的糖分解酶，大肠埃希菌有乳糖分解酶和葡萄糖分解酶，分解乳糖和葡萄糖产酸，并进一步分解代谢产物产气，因此使指示剂变色并且出现气泡。福氏志贺菌可以分解葡萄糖产酸，但不产气，不可以分解乳糖。存放时间不宜过长，否则会使产气的微量发酵管的气体产出，导致看到的现象不明显。
6.药物敏感试验：敏感细菌在含有抗菌素的滤纸片周围不生长，形成抑菌圈。通过测定抑菌圈的直径来判定细菌对于抗菌素的敏感程度。金*色葡萄球菌和白色葡萄球菌都是革兰氏阳性菌，对庆大霉素、青霉素和链霉素都敏感。大肠埃希菌和福氏志贺菌都是革兰氏阴性菌，对青霉素不敏感，对庆大霉素和链霉素敏感。
7.兔血浆凝固酶试验：金*色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，附着于菌体表面，形成凝块。白色葡萄球菌不产生血浆凝固酶，不能使血浆凝固。实验时切记菌液量和血浆量要互相匹配。
8.半固体穿刺法试验：大肠埃希菌有鞭毛，能够运动，在半固体培养基中，能冲破琼脂的阻力，向周围扩散生长，使培养基呈云雾浑浊状态，动力学实验为阳性。福氏志贺菌无鞭毛，不能运动，动力学实验为阴性。切记接种针不能超过半固体4/5的，接种针要按原路返回。
9.血清学凝集实验：福氏志贺菌诊断血清实验，血清中含福氏志贺菌的特异抗体，可与福氏志贺菌特异性结合，产生凝集反应可以诊断粉红色菌落的细菌为福氏志贺菌。兔血浆凝固酶试验，金*色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白，附着于菌体表面，形成凝块，保护细菌不被吞噬。实验时切记菌液量和血清量要互相匹配。
（五）思考题
1.如果细菌生化反应结果不佳，原因何在?
?糖发酵试验:接种细菌时接种过少或者没有,对试验的现象有一定的影响;存放时间不宜过长，否则会使产气的微量发酵管的气体产出，导致看到的现象不明显。
?滤纸片扩散法药物敏感试验:平板划线时决定了后期的药敏试验是否成功,因此划线时应该严格按照要求.
?凝固酶试验:接种的细菌过少时,凝集现象不明显,只有当菌液两和血清量互相匹配时,现象才会比较明显.
④半固体穿刺法实验:试验结果的成功与否取决于接种时是否垂直接种以及是否原路返回.
2.报告纸片法药敏试验结果，是否符合你所鉴定的细菌的药敏特性?
符合。敏感细菌在含有抗菌素的滤纸片周围不生长，形成抑菌圈。通过测定抑菌圈的直径来定细菌对于抗菌素的敏感程度。查询资料得，金*色葡萄球菌和白色葡萄球菌都是革兰氏阳性菌，对庆大霉素、青霉素和链霉素都敏感。大肠埃希菌和福氏志贺菌都是革兰氏阴性菌，对青霉素不敏感，对庆大霉素和链霉素敏感，所得出的试验结果与资料大致符合，说明符合我鉴定的细菌药敏特性.
3.玻片凝集试验观察完毕，应将载玻片立即放入消*缸内，为什么?
消*缸具有杀菌的功效，将玻片凝集试验后的载玻片放在消*缸后，可杀灭细菌。防止细菌污染环境。
一只厌学虫尊重知识，一起厌学