(这是Hmaide的第篇推送)
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感谢17级生物技术刘飞昌的投稿~
年南方医科大学微生物实验报告
日期：年5月10日
实验名称
浓汁和粪便标本中的病原菌检测
学院
检验与生物技术学院
年级专业
级生物技术
姓名、学号
刘飞昌
指导老师
谢老师
一、实验目的
1.了解细菌生长的基本营养条件，熟悉培养基的种类，掌握培养基制备的原则和一般方法；
2.掌握无菌操作技术，掌握病原菌的分离与培养方法；
3.医院空气的有菌环境，加强消*灭菌的观念；医院病房空气的细菌检测方法；掌握空气的卫生细菌学监测指标及意义；
4.了解人体体表的有菌环境，加强消*灭菌的观念；
5.掌握油镜的使用方法，掌握细菌涂片标本的制备及革兰氏染色法的原理及操作，熟悉细菌的基本形态
6.掌握几种常用的生化反应的名称、原理、方法、结果讨论及用途；
7.掌握血浆凝固酶的原理、方法、结果观察及判断；
8.掌握抗菌素敏感性试验的种类、原理及应用，掌握纸片扩散法；
9.掌握玻片凝集反应试验的原理、方法、结果观察及判断。
二、实验器材
1.培养基的制备：试管架、移液管、棉塞、牛皮纸、手套、石棉网、橡皮筋、蒸馏水、天平、称量器皿、药勺、锥形瓶、量筒、电炉、试管、洗耳球、干粉培养基。2.细菌的分离培养：接种环，酒精灯，打火机，浓汁标本1支，粪便标本1支；碘酒棉球1瓶，酒精棉球1瓶，眼科镊子2把；伊红美蓝平板2个，营养琼脂平板5个。3.细菌的纯培养：接种环，酒精灯，打火机，中性笔，斜面4支，细菌分离培养物（上次实验平板）4.细菌的形态学检查：接种环，酒精灯，打火机，中性笔，斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1本，载玻片4张，显微镜，革兰氏染色试剂6组，染色架8个。5.细菌的生化试验等：接种环，接种针，酒精灯，打火机，中性笔，斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，镊子2把，兔血浆，生理盐水。6.细菌的血清学试验、结果分析：接种环，酒精灯，打火机，玻片、志贺菌诊断血清，半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。
三、实验步骤
1.培养基的制备
1.1小组分工
组号
培养基
称量（g）
水量(ml)
煮沸次数
分装（ml）
备注（48人份）
1
营养琼脂
11.4
-
-
5瓶，ml瓶，平板
2,3,4,11
营养琼脂
2.7
70
3
5
13支×4，中试管，斜面
5～7
营养肉汤
1.2
54
1
3
17支×3，小试管，肉汤
8,9,10,12
半固体琼脂
1.6
56
3
4
13支×4，小试管，高层
1.2操作过程
1.3注意事项①称量时：调零，使用时遵循“左物右码”。天平保持干燥、清洁。用过的药勺、称量皿要清洗干净。②使用完干粉培养基后，瓶子内盖扭紧，外盖盖紧。③煮沸培养基时：培养基隔石棉网煮沸，使完全溶解（加热时常摇动，沸腾时，不能摇动）。营养肉汤煮沸1次，含琼脂的培养基煮沸3次(煮至刚刚冒泡,立即放置台面，半分钟后再煮)。④分离培养基时：培养基乘热分装，用洗耳球和刻度吸管分装培养基。棉塞1/2塞入试管口内，松紧合适。⑤培养基装筐待灭菌：放置试管筐内，罩上硫酸纸牛皮纸，用橡皮筋扎好。⑥刷洗玻璃器材：Ⅰ无污染器皿:洗涤剂洗刷→流水冲洗10次→晾干。Ⅱ病原菌污染的器材→高压蒸汽灭菌→趁热倒出污物→洗涤剂浸泡→瓶子、试管、吸管用毛刷，平皿用纱布，洗刷干净→流水冲洗10次→晾干。
2.细菌的分离培养
2.1小组分工
个体
标本类型
平板类型
甲
脓汁标本
营养琼脂平板
乙
脓汁标本
营养琼脂平板
丙
粪便标本
伊红美蓝平板
丁、戊
粪便标本
伊红美蓝平板
2.2采用平板划线分离法
①接种环烧灼灭菌。
②取标本3～6ul。
③平板采光，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。
④接种环与平板呈30～40度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。
⑤烧掉接种环上多余的标本。
⑥转动平板，通过第一区5～7次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。
⑦转动平板，接种环通过第二区1次，划第三区。转动平板，接种环通过第三区1次，划第四区。转动平板，种环通过第三区1次，第五区。
2.3注意事项
①划线：每区划线不少于30条，整个平板划线不少于条线。上下两条线重叠不影响分离结果。第一区划线不得超过1/5平板。
②接种环：使用前，直接在酒精灯上烧灼灭菌，把环和金属丝烧红即可，接种环3～5秒钟冷却。使用后，先在火焰背面将把环上标本烤干，再烧灼灭菌，以免标本汽化，爆烈四溅，污染环境。金属杆快速通过火焰2～3次，杀灭表面微生物。
③操作时在无菌操作区（火焰周围10～20cm范围内）操作，避免气溶胶中的杂菌垂直落入平板导致平板被污染。
④接种环取液体标本的方法
环面离开液面
快速
慢速
水平
6ul
2ul
垂直
3ul
1ul
⑤无菌取材：在火焰旁边，左手斜持标本管下端，右手小指夹住试管棉塞上端，缓慢拔出棉塞并夹持之（棉塞下端不得接触到管口外任何物体）→管口迅速通过火焰3次→取标本→管口通过火焰三次，塞棉塞。
3.细菌的纯培养
3.1小组分工
个体
平板
菌落颜色
斜面培养基
甲
普通平板
金*色菌落
1支斜面
乙
普通平板
白色菌落
1支斜面
丙
EMB平板
紫黑色菌落
1支斜面
丁
EMB平板
粉红色菌落
1支斜面
3.2细菌的纯培养采用斜面接种法
①在菌落分布最稀疏的区域，选择平板上相同的菌落数多的、典型的、容易挑取的单菌落。
②接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉一条细菌接种线。
③再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线。接种时，接种杆连接部不能碰到斜面培养基。
④细菌涂布接种在斜面培养基的表面。
3.3注意事项
①接种完后：收集平板→灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。
②接种时：甲在接种金*色葡萄球菌时，不可挑选。*色菌落可能是空气污染的杂菌，不能挑选。
4.空气的细菌学检查
4.1实验方法(自然沉降法)
根据空气中细菌气溶胶粒子，在地心引力的作用下，以垂直的自然方式沉降到培养基表面，培养以后，计数菌落形成单位，可了解空气的污染情况。
4.2实验步骤
每组1个琼脂平板，做标记。选择采样地点：实验室、卫生间或任选地点。严格无菌操作，将平板盖打开，移动放置在平皿边缘；平板暴露于空气中15分钟，反向盖上。37℃温箱培养24小时，观察结果。
4.3计算方法
CFU/m3＝00N÷AT≈86N(直径7cm平板）。
N：平板上的菌落数A：平板面积(平方厘米)T：采样时间(分钟)。
5.手指皮肤的细菌学检查
5.1小组分工：假设同一只手中间三个手指皮肤环境密切相关、细菌数量相当，分别作洗手、消*前后细菌学检查。
平板1
甲
乙
常规洗手
标准洗手
平板2
丙
丁
常规洗手
标准洗手
5.2操作过程
5.2.1常规的洗手方法（甲和丙操作）——能有效地去除大多数暂住菌
5.2.2医学微生物学教学实验室标准洗手方法（乙丁操作）
5.2.3三个手指分别在培养基表面触摸2～3厘米
第1格为洗手前，
第2格为洗手后，
第3格为消*后，
第4格空白对照。
6.细菌的形态学检查
6.1革兰染色法
6.1.1分工如下
甲
金*，紫黑
丙
白色，粉红
乙
金*，紫黑
丁
白色，粉红
6.1.2主要步骤
涂片：
①接种环取盐水3ul×2滴,水滴间距小于2cm。
②取菌苔少许（1mm小菌落半个）与盐水混匀，涂成大于1cm2均匀涂膜。
③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。
干燥：
①手持载玻片一端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2～3秒钟。
②促使菌体蛋白质凝固，固定在载玻片上，以免染色水洗的时候，细菌被水洗掉。
染色：
6.1.3注意事项——油镜的使用：
6.2液体培养基接种——悬浮法：
6.2.1小组分工
甲
乙
丙
丁
金*
白色
紫黑
粉红
6.2.2操作过程
①接种环斜面取菌，在靠近培养基液面管壁上，上下研磨接种。
②在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌。
7.细菌的生化试验7.1糖发酵实验
7.1.1小组分工
序号
类别
颜色
物质
①
甲
紫黑
葡萄糖
②
乙
紫黑
乳糖
③
丙
粉红
葡萄糖
④
丁
粉红
乳糖
7.1.2操作过程
观察细菌对糖的分解情况,常用于肠道杆菌鉴定。①用砂轮在糖发酵管液面上方2～3cm处切割，然后，向切口外侧分离掰断，管口烧灼灭菌。②接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。③退出接种针，烧灼灭菌。④管口朝向相同，放置在平皿内。
7.2抗菌素敏感性试验
7.2.1小组分工
序号
类别
颜色
①
甲
金*菌液
②
乙
白色菌液
③
丙
紫黑菌液
④
丁
粉红菌液
7.2.2操作步骤
划平板：①先取菌液3～6ul。②沿平板直径拉一条细菌接种。③再取菌液1次。④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”。然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板。⑤旋转平板90度角，二次密集划线。⑥转平板90度角，三次密集划线。⑦转平板90度角，四次密集划线。贴药物纸片：①设三点,呈等边三角距离。点距离平板边缘约15mm。作标记：青、链、庆。②镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。7.3凝固酶试验7.3.1浆(rabbitplasma)置于洁净的玻片上。7.3.2种环取白色和金*色菌苔(约2～3个菌落的菌量)与血浆研磨混合成直径8～10mm的一层薄菌膜，立即观察结果。7.3.3显凝块者为阳性，否则为阴性。7.4半固体穿刺接种法
7.4.1小组分工
甲
乙
丙
丁
紫黑
紫黑
粉红
粉红
7.4.2操作过程①接种针斜面取菌，从半固体中心,垂直刺入，到达培养基底部5分之4处，再循原来的路线,退出接种针。②管口、接种针经火焰烧灼灭菌。
8.细菌的血清学试验、结果分析
8.1取洁净的载玻片一张，将磨面近端设为对照区，滴加生理盐水15ul。远端设为试验区，滴加福氏志贺菌诊断血清15ul，
8.2用接种环分别取粉红色菌苔，约2个小菌落的菌量，研磨于盐水或血清内，混合均匀。
四、结果与讨论
1.培养基的制备
我们组是第7组，制备的是半固体培养基，小组四人分工合作，齐力完成。
2.洗手前后对比
2.1比较洗手前后细菌的种类和数目：
比较洗手前后细菌的种类和数目：洗前细菌种类多，洗后细菌种类少，说明洗手能洗掉大多数暂住菌比较常规和标准洗手的细菌数量：常规（简单）洗手，平板上细菌数量少。标准洗手，平板上细菌数量多。
2.2若常规（简单）洗手，平板上细菌数量少。标准洗手，平板上细菌数量多。洗手前细菌数量少于洗手后细菌数量，这与预期结果（预期是洗手后细菌数量应少于洗手前）不一样，是因为常住菌数量大，牢固附着在皮肤上，常洗不掉，可洗松动，经摩擦接种、脱落到培养基上，因此显示细菌更多。暂住菌大多都是致病菌，常住菌一般对人体无致病作用，因此外科手术人员在进行手术前应充分清洗双手并消*，确保无菌的原则。
2.3碘酒和酒精棉球消*以后，没有细菌生长。
3.空气中细菌检查结果
细菌菌落直径：1-4mm采样地点：男卫生间
平板直径：7cm放置时间：15min
形成菌落数;12个
CFU/m3＝00N÷AT≈86N=
4.细菌的分离制备结果
标本类型
培养基类型
菌落类型
菌落形态
浓汁标本
普通琼脂平板
金*色和白色
菌落直径2mm左右、圆形、隆起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明
粪便标本
伊红美蓝平板
紫黑色和粉红色
紫黑色菌具有金属光泽、大而隆起、不透明，菌落直径2～3mm。粉红色菌半透明，直径1～2mm
小组内的丙同学划线结果最好，本人为丁同学，划得最差。主要失误原因是第一次划平板，没经验，而且取的脓汁过多（细菌量多），划到后面的时候第五区基本和第一区重复了，使得菌落十分密集，且杂乱无章，基本的单一的菌落，会对接下来的实验造成影响。
因此，第一次划平板可以先在背面用标记笔先划好五个区域，然后再用接种环划线就能减少不必要的误差。
5.细菌的纯培养
5.1从普通平板上挑取的金*色或白色菌落接种的斜面，菌苔的颜色，还是原来菌落的颜色，金*色或白色。
5.2从伊红美蓝平板上挑取的紫黑色或粉红色菌落接种的斜面，菌苔已没有原来菌落的颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明或半透明。
6.细菌的形态学检查结果
镜下观察结果：
6.1用普通平板，从浓汁标本中分离得到*色、白色两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G+球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是典型的葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金*色葡萄球菌和白色葡萄球菌。
6.2用伊红美蓝平板，从粪便标本分离、获得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大肠埃希菌。粉红色菌落是不能分解乳糖的致病菌。显微镜下，均为G-杆菌，散在排列，从形态上不能鉴别是什么细菌。
7.血浆凝固酶凝集试验结果
金*色菌和血浆凝固酶凝集试验为阳性，白色为阴性，则金*色菌为致病菌。
8.福氏志贺菌血清凝集试验结果
紫黑色和福氏志贺菌血清凝集试验为阴性，粉红色为阳性，则粉红色菌为致病菌。
9.细菌的糖酵解试验结果
管号
现象
是否分解乳糖类
是否
产酸
是否
产气
①
紫黑色菌+葡萄糖
指示剂变*，有气泡
是
是
是
②
紫黑色菌+乳糖
指示剂变*，有气泡
是
是
是
③
粉红色菌+葡萄糖
指示剂变*，无气泡
是
是
否
④
粉红色菌+乳糖
指示剂不变*，无气泡
否
否
否
10.细菌抗敏性实验结果
10.1金*色和白色菌对青霉素、头孢曲松、庆大霉素都产生阳性反应紫黑色和粉红色菌仅对头孢曲松、庆大霉素产生阳性反应
10.2测量抑菌圈直径，据下表来判断各菌的敏感程度：
抗菌药物
纸片含药量
抑菌圈直径（mm）
耐药
中度敏感
敏感
青霉素
30毫克
≦28
-
≧29
头孢曲松
10毫克
≦19
20-22
≧23
庆大霉素
30毫克
≦12
13-14
≧15
10.3可得下列结果
菌的类型
青霉素
头孢曲松
庆大霉素
直径
敏感程度
直径
敏感程度
直径
敏感程度
金*色
40mm
敏感
24mm
敏感
29mm
敏感
白色
31mm
敏感
20mm
敏感
34mm
敏感
紫黑色
-
耐药
32mm
敏感
26mm
敏感
粉红色
-
耐药
35mm
敏感
28mm
敏感
11.半固体接种法实验结果
11.1紫黑色菌在半固体中自接种部位向周围移动扩散生长，使培养基呈根须装或云雾状浑浊状态。因此紫黑色菌具有鞭毛。
11.2粉红色在半固体中沿穿刺线生长繁殖，穿刺线周围边缘清晰，周围培养基清澈透明。因此粉红色菌无鞭毛。
12.常见肠道感染细菌主要生化反应特征
葡萄糖
乳糖
半固体（动力）
大肠埃希菌
⊕
⊕
＋
福氏志贺菌
＋
－
－
伤寒沙门菌
＋
－
＋
霍乱弧菌
＋（产酸并杀死细菌）
－
＋
幽门螺杆菌
－
－
＋
变形杆菌
⊕
－
＋
由此判断紫黑色菌为大肠埃希菌，粉红色菌为福氏志贺菌
五、试验结果总结
菌落
形态
血浆凝固酶
葡萄糖
乳糖
半固体
福氏血清
青霉素
头孢曲松
庆大霉素
结论
金*色
G+球
＋
＋
＋
＋
金*色葡萄球菌
（致病菌）
白色
G+球
－
＋
＋
＋
白色葡萄球菌
紫黑色
G-杆
⊕
⊕
＋
－
－
＋
＋
大肠埃希菌
粉红色
G-杆
＋
－
－
＋
－
＋
＋
福氏志贺菌
（致病菌）
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